| Abstract : |
Fingolimod (FTY720 - Gilenya®) is een sfingosine-1-fosfaat analoog die gebruikt wordt als geneesmiddel voor relapsing-remitting multiple sclerose (RR-MS). De effecten van fingolimod op de proliferatie van B-cellen zijn voorlopig nog niet gekend. Binnen het onderzoek naar deze effecten werd er een optimalisatie uitgevoerd van de Kappa-deleting recombination excision circle (KREC)-analyse die gebruikt wordt voor het bepalen van de replicatiegeschiedenis van B-cellen. B-cellen werden geïsoleerd uit bloed van MS-patiënten behandeld met fingolimod of interferon-β en werden gesorteerd met behulp van Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) (transitionele (CD24++ CD38++), naïeve mature (CD27- IgD+), IgG+ geheugen (CD27+) en dubbel negatieve IgG+ (CD27- IgD-)). De gebruikte sorting strategie leverde zuivere subpopulaties op die geschikt waren voor verdere analyse. Er werd genomisch DNA (gDNA) uit de B-celsubtypes geëxtraheerd via een directe cellyse en gebruikt voor het uitvoeren van de KREC-analyse. Deze was niet succesvol en de resultaten toonden aan dat voor deze onderzoeksopzet een directe cellyse niet de aangewezen gDNA-extractiemethode is. Daarom werden er twee andere gDNA-extractiemethodes (GenElute™ Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit en een in-house protocol) uitgetest op 40.000, 60.000 en 100.000 naïeve mature B-cellen uit het bloed van zes gezonde controles. De kit in combinatie met een celaantal van 40.000 cellen leverde voldoende gDNA op voor verdere analyse. Deze combinatie werd daarom ook toegepast op de drie andere subtypes waarbij opnieuw cellen van zes gezonde controles gepoold werden om aan 40.000 cellen te komen. Met het gDNA werd de KREC-analyse uitgevoerd en kon voor elk subtype de replicatiegeschiedenis bepaald worden. De transitionele en naïeve mature B-cellen hadden gemiddeld één celdeling ondergaan. De CD27+ IgG+ en de dubbel negatieve IgG+ B-cellen hadden respectievelijk gemiddeld 14 en 16 celdelingen ondergaan. Bij de geheugensubtypes konden er meer KREC-delingen gedetecteerd worden dan bij de andere subtypes. Dit resultaat voldoet aan de verwachtingen aangezien geheugen-B-cellen meer celdelingen hebben ondergaan dan naïeve mature en transitionele B-cellen. Deze resultaten tonen aan dat de KREC-analyse succesvol was en dat het gDNA, geïsoleerd met de kit, geschikt is voor de uitvoering ervan. Het geoptimaliseerde protocol, waarbij het gDNA geëxtraheerd wordt met de kit uit 40.000 cellen, kan in de toekomst gebruikt worden voor het onderzoek naar de effecten van fingolimod op de proliferatie van B-cellen in MS.
Promotoren:
drs. Nele Claes, Biomedisch Onderzoeksinstituut UHasselt
dr. Judith Fraussen, Biomedisch Onderzoeksinstituut UHasselt
Prof. dr. Veerle Somers, Biomedisch Onderzoeksinstituut UHasselt
dr. ir. Ilse Smets, Hogeschool PXL
|
Home 
